Геном покоящихся CD4+ Т-клеток можно редактировать без их активации
Ученые из Германии впервые успешно осуществили CRISPR-Cas9-редактирование покоящихся CD4+ Т-клеток без их активации. Для этого они вносили в клетку рибонуклеопротеидный комплекс из направляющей РНК и рекомбинантного белка Cas9 с сигналом ядерной локализации. Ученые продемонстрировали, что их методику можно использовать в исследованиях по терапии ВИЧ-инфекции.
В отличие от активированных, покоящиеся CD4+ Т-клетки обладают достаточно высокой резистентностью к ВИЧ. Анализ причин резистентности затруднен из-за отсутствия эффективных протоколов редактирования геномов таких клеток. Для изучения покоящихся CD4+ Т-клеток иногда применяют альтернативный протокол — редактируют их во время активации и затем возвращают клетки в состояние, фенотипически схожее с состоянием покоя. Однако остается риск, что такие клетки недостаточно похожи на покоящиеся, чтобы использовать их в качестве модели. В новой работе ученые из Германии разработали метод, который позволяет эффективно редактировать покоящиеся CD4+ T-клетки.
Покоящиеся CD4+ T-клетки не делятся, и очень важно обеспечить им оптимальные условия культивирования после извлечения из крови донора. Авторы выяснили, что культивирование клеток в присутствии интерлейкинов IL-7 и IL-15 позволяет поддерживать их в жизнеспособном состоянии в течение шести недель. Анализ уровней экспрессии маркеров активации показал, что клетки при этом не переходят в активированное состояние.
Обычно трансфекция покоящихся CD4+ T-клеток неэффективна, поскольку проникновение внесенной ДНК в ядро происходит при делении клетки. Ученые применили нуклеофекцию — метод, который позволяет реагентам проникать сразу в ядро. При нуклеофекции для получения нокаутов в клетки доставляли не ДНК, а непосредственно рибонуклеопротеидные комплексы из гидовой РНК и рекомбинантного белка Cas9 с сигналом ядерной локализации. Если необходимо внести в геном чужеродный генетический материал, систему дополняют фрагментом двухцепочечной ДНК для гомологичной рекомбинации.
Эффективность нокаутов генов CD46 и PSGL-1 составила 85% и 93% соответственно, и через две недели после нуклеофекции эти белки почти не детектировались в клетках. Кроме того, удалось произвести множественный нокаут пяти генов, играющих важную роль в развитии ВИЧ-инфекции (CD4, CXCR4, PSGL-1, TRIM5α и CPSF6), а также гена CD46. В этом случае белки всех шести генов также не детектировались в клетках спустя две недели. Жизнеспособность клеток при одиночном нокауте почти не снижалась, а в случае множественного нокаута снижалась всего на 20%.
Белок исчезает из клетки не сразу, это связано со временем деградации его мРНК и непосредственно белка, которое разное для каждого гена. Например, рецептор CXCR4 не детектируется в клетках уже через неделю после редактирования, а растворимый белок SAMHD1 перестает детектироваться лишь спустя шесть недель. Кроме того, авторы внесли в геном флуоресцентные репортерные гены с эффективностью от 1 до 20% с последующим сортингом.
Нокаут CXCR4 сделал клетки резистентными к заражению ВИЧ-1, а нокаут SAMHD1 привел к снижению резистентности к ВИЧ-1, но не к гибридному вирусу, в состав которого включен белок Vpx. Это соотносится с известной ролью этих белков. Нокаут MX2 практически не повлиял на заражение клеток ВИЧ-1, несмотря на важную роль этого белка при заражении других типов клеток. А эффект от потери CPSF6, наоборот, оказался более значительным, чем в других типах клеток.
Авторы подчеркивают, что модификация генома может быть интересна не только для исследования взаимодействия ВИЧ и покоящихся CD4+ Т-клеток, но и для изучения биологии иммунных клеток.
Статья Albanese et al.
Rapid, efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses опубликована в журнале Nature Methods.
Мария Мошарева, PCR.news
Портал «Вечная молодость» vechnayamolodost.ru
