Клетку проткнули электрическим нанофонтаном
Американские ученые предложили доставлять биологические молекулы внутрь отдельных клеток с помощью нанофонтанного зонда, который протыкает клеточную мембрану генерируемым импульсом и впрыскивает вещество в ее цитозоль. С помощью зонда ученым удалось ввести вглубь клетки меченный флуоресцентным белком бычий сывороточный альбумин, а в будущем технология позволит внедрять внутрь клетки практически любой молекулярный груз – с лечебными или исследовательскими целями.
Об этом рассказывается в журнале Small (Nathamgari et al., Nanofountain Probe Electroporation Enables Versatile Single‐Cell Intracellular Delivery and Investigation of Postpulse Electropore Dynamics).
Молекулы внутрь клетки можно доставлять самыми разными способами: например, вирусными векторами или при помощи химических носителей – простых пептидов или полимерных нанокапсул. Кроме того, для этого также применяют катионно-липидный реагент липофектамин или метод объемной электропорации. У каждого способа есть свои плюсы, но и ограничения: так, вирусные векторы при всей своей эффективности могут вызывать неблагоприятные иммунные реакции или генотоксичность, а химические носители зачастую оказываются губительными для самой клетки.
Кроме того, эксперименты с доставкой веществ внутрь клеток необходимо проводить на генетически однородных клеточных популяциях. Обычно, чтобы избежать генетически смешанных популяций клеток, требуется вырастить и отобрать отдельные клетки, которые потом будут производить линии идентичных им клонов. Однако сам этот способ отбора клеток чрезвычайно сложен и требует много времени.
Ученые под руководством Горацио Эспиноза (Horacio Espinosa) из Северо-Западного университета придумали, как обойти эти проблемы. Они предложили способ электропорации отдельных клеток с помощью электрического импульса, который генерируется нанофонтанным зондом – стеклянной микропипеткой с размером наконечника менее одного микрометра. Подобные микроэлектроды ранее уже использовались, например, для фиксации локального потенциала на клеточной мембране. Теперь же ее применили для электропорации оболочки эукариотической клетки.
Модель доставки молекулярного груза нанофонтанным зондом.
Сперва ученые создали математическую модель взаимодействия зонда с живой поверхностью, чтобы предсказать поведение сформированной электрической цепи. Так они смогли определить оптимальные параметры электрического воздействия на мембрану, и только потом применили их на живых клетках.
Эксперимент с проколом мембраны и последующим транспортом молекул внутрь конкретной клетки проходил в три этапа: сперва производился заряд мембраны, затем электрический импульс с электрода проделывал в ней отверстие и, наконец, содержимое пипетки впрыскивалось в цитозоль клетки. По толщине самой мембраны, разности электрических потенциалов на ней и сопротивления места контакта электрода с поверхностью ученые рассчитывали силу электрического импульса, который требовался для создания поры и впрысквания вещества.
С помощью зонда удалось перенести молекулу бычьего сывороточного альбумина, помеченную флуоресцентным белком, внутрь отдельной первично выращенной клетки, а также в клетку линии HeLa. При этом клетки оставались неповрежденными.
Затем исследователи сравнили эффективность переноса веществ внутрь клеток с помощью нанофонтанного зонда с аналогичным методом трансфекции при помощи плазмид. Они продемонстрировали, что новая система в 95 процентах случаев обеспечивает успешную доставку молекул белков, ДНК и РНК в различные «бессмертные» клеточные линии (такие как клетки HeLa) или в культуру первичных клеток эукариот. При этом только 10 процентов клеток в результате таких манипуляций погибало – это, по словам авторов, не так много. Подобная эффективность и малая инвазивность обеспечивались тонкой настройкой параметров электрического воздействия на живую систему клетки, что значительно снижает вероятность ее гибели.
Новый метод подходит для клеточной терапии и для изучения некоторых заболеваний. В первом случае речь идет о редактировании генома и иммунотерапии, например, для лечение онкологических заболеваний путем перепрограммирования Т-лимфоцитов. Во втором случае – о контроле за протеканием врожденных генетических недугов. Кроме того, зонд позволяет исследовать динамику заживления поры в клетке, после того, как та была подвергнута импульсному воздействию.
Путем сочетания электропорации единственной клетки и покадровой флуоресцентной визуализации исследователям удается фиксировать время, которое необходимо для закрытия временно образовавшихся пор. Это важно для понимания необходимости в повторном электрическом воздействии на мембрану, например, для того, чтобы отобрать из клетки контрольные пробы вещества и при необходимости увеличить объемы доставляемого молекулярного груза.
Наиболее перспективное применение электрического нанофонтанного зонда – доставка факторов плюрипотентности и контроль за их концентрациями при перепрограммировании человеческих стволовых клеток. Кроме того, с помощью него можно строго контролировать дозировку cas-белков в технологии редактирования генома CRISPR/Cas9.
Недавно немецким исследователям удалось адресно доставить внутрь раковых клеток лекарство при помощи наночастиц на основе гликопротеина муцина с присоединенной к нему молекуле ДНК.
Алексей Козлов, N+1
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
