Биотехнологи научились внедрять в геномы гигантские фрагменты ДНК
Ученые Массачусетского технологического института разработали новый инструмент редактирования генов PASTE на основе технологии CRISPR, который может вырезать дефектные гены целиком и заменять их более эффективным и безопасным способом. Метод позволяет внедрять в геномы гигантские фрагменты ДНК длиной несколько тысяч нуклеотидов. Об этом сообщается в статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology (Yarnall et al., Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases).PASTE сочетает в себе технологию CRISPR-Cas9 и ферменты интегразы. CRISPR-Cas9 представляет собой генетические «ножницы», которые изначально использовались бактериями в борьбе с вирусами. Белок Cas9 разрезает двойную цепочку на определенном участке гена-мишени, который определяет направляющая РНК. Если рядом находится отдельный отрезок ДНК, то он встраивается в место разреза.
Недостатком CRISPR является то, что Cas9 производит двухцепочечные разрывы, которые могут приводить к крупным повреждениям ДНК или даже хромосомным перестройкам, вызывающим гибель клетки или ее перерождение в раковую. Другим ограничением является отсутствие в неделящихся клетках активированных механизмов репарации ДНК, необходимых для встраивания нужного участка гена. Чтобы решить эту проблему, исследователи использовали большие сериновые интегразы — ферменты бактериофагов, которые встраивают вирусные последовательности ДНК в геном клетки-хозяина, а именно в специфические сайты attB (от англ. attachment) длиной 30-50 нуклеотидов.
PASTE основан на методе праймированного редактирования генома (англ. prime editing). Сначала комплекс, состоящий из направляющей РНК и Cas9, связывается с целевой последовательностью ДНК, после чего модифицированный Cas9, называемый никазой, делает одноцепочечный разрез. Фермент обратная транскриптаза использует связанную с комплексом дополнительную РНК-цепь как шаблон для синтеза нужного ДНК-фрагмента на месте разреза. Таким образом, ученым удалось встроить сайт attB длиной 46 пар оснований, таким образом внедрив «посадочную площадку» для сериновой интегразы, которая активна даже в неделящихся клетках.
Исследователи продемонстрировали интеграцию последовательностей размером до 36 тысяч оснований в трех линиях клеток человека, включая лимфобласты, первичные Т-клетки и неделящиеся первичные гепатоциты человека. Они протестировали систему доставки с 13 различными генами, встроив их в девять различных мест в геноме. Вероятность успешной вставки составила 5-60 процентов, при это метод дал очень мало нежелательных вставок.
В настоящее время авторы изучают возможность использования PASTE в качестве возможного способа замены дефектного гена, вызывающего кистозный фиброз. Этот метод также может быть полезен для лечения заболеваний крови, вызванных мутациями, таких как гемофилия ,или болезни Гентингтона, неврологического расстройства, вызванного избытком нуклеотидных повторов.
Лента.ру
Портал «Вечная молодость» vechnayamolodost.ru
