Компоненты CRISPR/Cas9 для лечения рака доставили в опухоль с помощью липидных наночастиц
Рис.1. Генетическое редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9. Эндонуклеаза Cas9 (изображена в виде двух светло-голубых овалов) находит участок генома, в котором требуется произвести направленную генетическую модификацию, с помощью искусственно синтезированной направляющей РНК (guide RNA). В нее входит участок crRNA, комплементарный целевой последовательности, а также транс-активирующая РНК (tracrRNA), которые соединены между собой линкером (прерывистая линия). В распознавании целевой последовательности также участвует последовательность ДНК PAM (protospacer adjacent motif). Эндонуклеаза Cas9 разрезает ДНК по обеим цепочкам. Образовавшийся двойной разрыв ДНК может привести к делеции в целевом участке ДНК и разрушению целевого гена. Иллюстрация с сайта mirusbio.com.
Систему точечного редактирования генома CRISPR/Cas9 постепенно удается приспособить для использования в медицине. В том числе – для борьбы с онкологическими заболеваниями. В недавнем исследовании удалось показать, что CRISPR/Cas9 можно использовать для направленного уничтожения раковых клеток. Для этого компоненты системы, настроенные на вырезание гена PLK1, помещали в специальные липидные наночастицы, которые вводили в опухоли, индуцированные у мышей. Такая терапия показала хорошие результаты и против глиобластомы, и против аденокарциномы яичника, в обоих случаях значительно увеличивая продолжительность жизни мышей и сокращая размер опухолей.
Использование «молекулярных ножниц» системы CRISPR/Cas9, которые позволяют точечно редактировать геном, дало новый толчок исследованиям в генной инженерии. В этом году пионерские работы по изучению этой системы и внедрению ее в практику были отмечены Нобелевской премией. «Элементы» уже неоднократно рассказывали и об этой системе, и о разнообразных ее применениях. Например, с ее помощью были получены тысячи линий клеток и лабораторных животных с заданными свойствами.
Кроме того, у геномного редактирование при помощи CRISPR/Cas9 есть огромный терапевтический потенциал, в том числе – и для борьбы с раком. Систему CRISPR/Cas9 уже пытаются применять для лечения некоторых заболеваний. Пока эти работы находятся на стадии клинических исследований, но вполне можно надеяться, что их прогресс не заставит себя ждать. Так, весной 2020 года было объявлено (H. Ledford, 2020. CRISPR treatment inserted directly into the body for first time) о первом введении системы CRISPR/Cas9 напрямую в сетчатку пациента, страдающего от амавроза Лебера – наследственного заболевания, приводящего к потере зрения. А совсем недавно в журнале New England Journal of Medicine были опубликованы результаты успешной коррекции мутаций у пациентов с бета-талассемией (Beta-thalassemia) и серповидноклеточной анемией (H. Frangoul et al., 2020. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia).
В основе применения CRISPR/Cas9 для лечения онкологических заболеваний лежит та же идея, что и у химиотерапии: снижать активность протоонкогенов – генов, которые обычно регулируют деление клеток, но по какой-то причине (из-за мутации, увеличивающей активность белкового продукта, дупликации гена или по другим причинам) становится сверхактивными. Один из важных протоонкогенов – ген PLK1 (polo-like kinase 1). Продукт этого гена – киназа, которая активирует белки, необходимые для митоза. В клетках глиомы, меланомы, клетках рака груди, простаты, карциномы яичника и многих других наблюдается избыточная экспрессия этого гена (Z. Liu et al., 2017. PLK1, A Potential Target for Cancer Therapy). Сейчас проводятся клинические испытания препарата воласертиб (Volasertib), блокирующего работу PLK1-киназы у пациентов с различными злокачественными опухолями.
У химиотерапии есть ряд недостатков. Во-первых, требуется несколько раундов введения препаратов, а поскольку они действуют не избирательно (то есть не только на раковые клетки), то страдают и здоровые клетки. Из-за этого пациент многократно испытывает весь спектр нежелательных явлений (рвота, выпадение волос, анемия и т. д.). Во-вторых, некоторые раковые клетки становятся со временем устойчивыми к химиотерапии. Это происходит из-за того, что химиотерапевтические препараты запускают в опухоли эволюционный процесс: идет отбор клеток, которые способны выживать в их присутствии. Приспособившиеся клетки опухоли могут инактивировать препарат, не давать ему попасть в клетку или просто не реагировать на него, отключая системы контроля за состоянием клетки (например, ответ на повреждение ДНК). Схожий процесс можно наблюдать и при возникновении резистентности микроорганизмов к антибиотикам. Поэтому избавиться от избыточной экспрессии важного гена в раковой клетке раз и навсегда – отличная идея, и система CRISPR/Cas9 как раз может помочь в этом.
Авторы исследования под руководством профессора Дана Пира (Dan Peer) из Университета Тель-Авива использовали очень простой подход: они попытались с помощью системы CRISPR/Cas9 разрушить ген PLK1, способствующий избыточной пролиферации клеток опухолей. Спроектированная ими система состояла из двух молекул РНК (это одна из стандартных реализаций геномного редактирования на основе CRISPR/Cas8-систем). Первая молекула – матричная РНК, которая кодирует нуклеазу Cas9. Вторая молекула – направляющая РНК (single guide RNA, sgRNA), которая приведет нуклеазу к гену PLK1, после чего та сделает в нужном месте двуцепочечный разрыв, который приведет к разрушению гена.
Далее осталось решить только одну проблему: доставить эти РНК в клетки опухоли. Один из возможных способов – использовать липидные наночастицы (рис. 2). Они состоят из положительно и нейтрально заряженных липидных молекул, которые образуют комплекс с негативно заряженными нуклеиновыми кислотами. Такой «пузырек» с посылкой из РНК или ДНК взаимодействует с отрицательно заряженной мембраной живых клеток и сливается с ней. После этого в цитоплазму высвободится нуклеиновая кислота, которая уже в зависимости от назначения делает свое дело. Этот способ хорошо себя зарекомендовал в тех случаях, когда требуется доставлять в клетки небольшие молекулы нуклеиновых кислот. Здесь же ученым нужно было доставить довольно крупные РНК-комплексы.
Рис. 2. Получение липидных наночастиц (lipid nanoparticle), содержащих систему CRISPR/Cas9. Для сборки наночастиц использовали спиртовой раствор различных липидных молекул (lipid mixture in ethanol), матричную РНК, кодирующую нуклеазу Cas9 (Cas9 mRNA), а также направляющую РНК (sgRNA), соответствующую целевому гену. Сборку проводили в микрожидкостной системе NanoAssemblr. Изображение из обсуждаемой статьи в Science Advances.
Авторы начали с поиска липидных молекул для наночастиц-переносчиков. Они выбрали несколько подходящих молекул из разработанной той же научной группой библиотеки (см. S. Ramishetti et al., 2020. A combinatorial library of lipid nanoparticles for RNA delivery to leukocytes) и протестировали сначала их способность образовывать комплекс с РНК, а затем способность комплекса доставлять РНК Cas9/sgPLK1 в клетки. Из четырех рассмотренных вариантов, которые отличались друг от друга линкерной частью, выбрали тот, который образовывал более крепкие связи с молекулами РНК.
Также авторы модифицировали матричную РНК Cas9 с помощью 5-метоксиуридина, чтобы сделать ее более стабильной. Также такая модификация помогает избежать иммунного ответа организма на введение чужеродной РНК.
Для работы авторы выбрали два типа опухолевых клеток, соответствующие наиболее опасным разновидностям онкологических заболеваний. Клетки первого типа – так называемой линии 005 – получены из глиомы мышей, искусственно вызванной введением активированных онкогенов h-RAS и Akt (T. Marumoto et al., 2009. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors). При введении этих клеток в организм мышей образуются агрессивные глиобластомы. Продолжительность жизни у человека с таким диагнозом составляет всего 15 месяцев, а пятилетняя выживаемость – всего 3%.
Вторая клеточная линия – Ovcar8 – получена из высокозлокачественой аденокарциномы яичника. Эти клетки устойчивы к большому количеству препаратов химиотерапии, а при введении в организм мышей образуют многочисленные метастазы. Рак яичника нередко выявляется только на стадии метастазирования, когда шансы на выживание значительно снижаются. Поэтому поиск эффективной терапии против него – очень важная задача.
Культуры клеточных линий 005 и Ovcar8 успешно модифицировали с помощью новой разработанной системы: ген PLK1 был разрушен в 84% клеток линии 005 и в 91% клеток Ovcar8. Через 48 часов после добавления наночастиц деление клеток приостанавливалось, а через 96 часов жизнеспособность клеток значительно снижалась.
Этот результат очень обнадеживал, но до того, как протестировать наночастицы на настоящих опухолях, нужно было проверить, насколько хорошо мыши переносят их введение. Здоровым мышам вводили липидные наночастицы того же состава, но заключали в них РНК-комплексы, направленные на разрушение гена зеленого флуоресцентного белка (GFP). У мышей этого гена нет, поэтому такие частицы можно использовать в качестве контроля. Через сутки после введения проводили общий анализ крови мышей, а также измеряли уровень ферментов печени (чтобы проверить токсичность наночастиц) и уровень провоспалительных цитокинов, отражающих степень иммунного ответа. Значительных отклонений от нормы у мышей не наблюдалось. Но авторы подчеркивают, что в случае доклинических исследований этот аспект следует изучить подробнее.
Наконец, наночастицы с «антираковыми» РНК вводили мышам.
Сначала систему протестировали на индуцированной глиобластоме. Мышам вводили суспензию клеток линии 005 в гиппокамп, а через 10 дней вводили либо систему, направленную против гена PLK1, либо против GFP (контроль) прямо в образовавшуюся опухоль. Через два дня после введения РНК Cas9/sgPLK1 ген PLK1 повреждался в ~68% клеток. А через три дня после инъекции наночастиц в опухоль значительное количество ее клеток показывало признаки апоптоза. При этом окружающие опухоль неделящиеся нейроны, где активность гена PLK1 и так была низкой, оставались живыми.
Наконец, группе из 30 мышей с индуцированной глиобластомой вводили наночастицы c РНК Cas9/sgPLK1 (либо контроль в виде стандартного натрий-фосфатного буферного раствора или наночастиц с РНК Cas9/sgGFP) и изучали их выживаемость, а также измеряли сокращение размеров опухолей. 30% мышей, получивших активный РНК-комплекс, были живы через 60 дней после индуцирования опухоли. Все животные в контрольных группах погибли к 40-му дню. Средняя выживаемость увеличилась с 32,5 до более чем 48 дней, а размер опухоли значительно уменьшался.
После такого успеха авторы перешли к работе с клетками аденокарциномы яичника. Это было необходимо не только для проверки того, работает ли система на других опухолях, но и для того, чтобы протестировать ее возможности. Например, возможно ли направленное действие против опухолевых клеток.
Для лечения некоторых опухолей, например метастатических или злокачественных заболеваний кроветворной системы, препарат приходится вводить системно, чтобы он распределился по всем целевым клеткам. Очевидный недостаток этого метода, о котором уже говорилось выше, – химиотерапия влияет на весь организм. У систем доставки, основанных на липидных переносчиках, есть еще одна проблема: очень много липидных наночастиц из-за особенностей метаболизма оказывается в печени (A. Akinc et al., 2010. Targeted Delivery of RNAi Therapeutics With Endogenous and Exogenous Ligand-Based Mechanisms). Именно поэтому генетическая модификация клеток печени с помощью CRISPR/Cas9 обычно вполне успешна, достигая ~70% (J. Finn et al., 2018. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing). Чтобы модифицировать клетки в других органах, требуется либо введение непосредственно в опухоль, либо какая-то уловка, чтобы редактирование генома происходило только в целевых клетках.
Ранее авторы исследования разработали метод, который может решить эту проблему (N. Viega et al., 2018. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes). В липидные частицы, переносящие нуклеиновые кислоты, они включили еще один компонент – липопротеин, который способен взаимодействовать с антителом. Это антитело в свою очередь взаимодействует с белком, характерным для того или иного вида клеток (рис. 3).
Рис. 3. Схема сборки липидных частиц с мотивом для направленной доставки. В липидные наночастицы включают мицеллы с искусственным липопротеином (желто-красный). Белковая часть этого липопротеина способна взаимодействовать с антителами к рецептору целевых для введения липидных частиц клеток (красный треугольник). Иллюстрация из статьи N. Viega et al., 2018. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.
На поверхности клеток аденокарциномы яичника, в том числе клеток Ovcar8, находится белок EGFR – рецептор эпидермального фактора роста. Он присутствует и у других клеток организма, но на раковых клетках его особенно много. Именно этот белок находят антитела, которые присоединили к липидным наночастицам с РНК Cas9/sgPLK1. Мышам вводили суспензию клеток Ovcar8 в брюшную полость, чтобы образовались опухоли, а через 10 дней туда же вводили липидные наночастицы с антителом к рецептору EFGR. Через два дня после введения ген PLK1 повреждался в ~82% клеток. Модифицированные клетки также как и клетки глиобластомы умирали путем апоптоза, а общая выживаемость мышей с опухолью увеличивалась приблизительно на 80%.
Эти результаты позволяют с осторожным оптимизмом говорить о том, что получена новая система для борьбы с онкологическими заболеваниями. Во-первых, ее можно настраивать на модификацию различных онкогенов, используя правильно подобную направляющую РНК. Причем так можно не только разрушать гены, но и исправлять мутации. Во-вторых, можно использовать антитела, которые будут подходить к другим типам опухолей. Например, для некоторых видов рака молочной железы характерна сверхэкспрессия рецептора HER2, который можно использовать в качестве мишени для направляющего антитела. В-третьих, авторы показали, что для хорошего результата достаточно одного введения липидных наночастиц с РНК Cas9/sgPLK1. Это важное наблюдение для разработки терапии опухолей головного мозга. Гематоэнцефалический барьер – преграда для доставки химиотерапии к таким опухолям. Конечно, можно вводить терапию напрямую в опухоль, но многократное введение может быть опасным для пациентов. Поэтому однократное введение мощной терапии может быть хорошей стратегией для их лечения.
Наконец, эту систему на основе липидных наночастиц можно использовать не только для лечения онкологических заболеваний, но для генной терапии в других случаях.
Стоит отметить, что это не первое исследование с попыткой приручить систему CRISPR/Cas9 для терапии онкологических заболеваний. В 2019 году опубликовано схожее исследование, где систему использовали для разрушения гена липокаина-2, который связан с ростом клеток рака молочной железы (см. P. Guo et al., 2019. Therapeutic genome editing of triple-negative breast tumors using a noncationic and deformable nanolipogel). Однако авторы использовали другой вариант системы доставки, а вместо РНК использовали плазмиды, кодирующие Cas9 и направляющую РНК против гена липокаина-2. Эффективность модификации составила 53%.
Источник: Rosenblum et al., CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy // Science Advances. 2020.
Екатерина Грачева, «Элементы»
Портал «Вечная молодость» vechnayamolodost.ru
