Аденоассоциированные вирусы и CRISPR снова справились с мышечной дистрофией
Американские исследователи, которые разрабатывают подходы к исправлению мутаций в гене дистрофина при помощи CRISPR, описали еще одну эффективную систему возобновления синтеза этого белка в мышцах животных моделей. Для этого ученые разработали новую мышиную модель миодистрофии Дюшенна. Как сообщается в статье в Science Advances (Min et al., CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells), экспрессия дистрофина в мышцах экспериментальных мышей достигла 90 процентов от нормы.
Нарушение синтеза белка дистрофина в результате врожденной мутации приводит к развитию прогрессирующей с возрастом миодистрофии Дюшенна, которая ведет к смерти больного в возрасте 20–30 лет. Вредные мутации встречаются в среднем у одного из 3600 мальчиков.
Ген дистрофина имеет сложную структуру и состоит из множества кодирующих кусочков – экзонов. Делеции в нескольких из них приводят к появлению в гене стоп-кодона и синтеза укороченного нефункционального белка. Исследователи выяснили, что восстановить синтез рабочей версии дистрофина можно, удалив кусочек с мутацией при помощи так называемого «пропуска экзонов» (exon skipping). Так как края экзонов содержат участки узнавания для белка Cas9 (PAM), вырезать мутантные экзоны достаточно удобно при помощи системы CRISPR-Cas9.
Исследователи из университета Техаса под руководством Эрика Олсена (Eric Olson) ранее опробовали подход с CRISPR для вырезания 51 экзона в гене дистрофина для устранения мутации, которая обуславливает 13 процентов случаев заболевания. В новой работе ученые сосредоточились на другом типе мутации – делеции в 44 экзоне гена. Эта мутация отвечает за 12 процентов миодистрофии Дюшенна у людей.
В предыдущем случае у ученых была возможность проверить систему на собаках породы бигль, у которых встречаются случаи миодистрофии из-за общей с людьми мутации. Однако на этот раз для проверки эффективности удаления 44 экзона авторам работы пришлось создать новую модель миодистрофии и вывести мышей с соответствующей делецией в геноме. Дистрофин в мышцах модельных животных не детектировался.
Подбор направляющей РНК для вырезания 44 экзона осуществляли на стволовых клетках, взятых у пациента с миодистрофией Дюшенна. Из отредактированных клеток затем выращивали клетки сердечной мышцы. Ученым удалось подобрать эффективную направляющую РНК на участок гена, который совпадает у мыши и у человека. Направляющую РНК и ген белка Cas9 вводили мышам в составе отдельных вирусных векторов. Как и раньше, ученые использовали аденоассоциированный вирус серотипа 9 (AAV9), который имеет наибольшее сродство к мышцам. Кроме того, экспрессия CRISPR-Cas9 была ограничена тканеспецифичными регуляторными элементами.
Вирусные частицы вводили животным в мышцу либо в кровь. Оказалось, что при системной доставке (через кровь) экспрессия рабочей формы дистрофина в сердце достигает 80 процентов от нормы. Когда же концентрацию вектора, содержащего ген направляющей РНК, повысили в 10 раз, количество дистрофина в сердечной мышце составило уже 90 процентов от нормы.
Отсутствие дистрофина (красный) в человеческих кардиомиоцитах до терапии и после нее. Рисунок из пресс-релиза UT Southwestern Discovery made while editing genetic defect behind Duchenne muscular dystrophy – ВМ.
Из этого эксперимента исследователи сделали важный вывод, что количество направляющей РНК влияет на экспрессию Cas9 и лимитирует эффективность редактирования.
Для единственного одобренного на сегодняшний день препарата, действие которого основано на том же принципе пропуска экзонов (этеплирсен), эффективность вырезания составляет менее одного процента.
Дарья Спасская, N+1
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
