За последнее десятилетие система редактирования генов CRISPR-Cas9 произвела революцию в генной инженерии, позволив ученым вносить управляемые изменения в ДНК организмов. Система потенциально может быть использована для лечения различных заболеваний, но редактирование включает разрезание нитей ДНК, что приводит к необратимым изменениям генетического материала клетки.
В статье, опубликованной в журнале Cell, исследователи описали новую технологию редактирования генов CRISPRoff, которая позволяет управлять экспрессией генов с высокой специфичностью, оставляя последовательность ДНК сохранной. Метод, разработанный сотрудником Института Уайтхеда Джонатаном Вайсманом, доцентом Калифорнийского университета в Сан-Франциско Люком Гилбертом, кандидатом наук из лаборатории Вайсмана Джеймсом Нуньесом и коллегами, достаточно стабилен, чтобы сохранять эффект через сотни клеточных делений, а также полностью обратим. Это несложный инструмент, который может заставить замолчать и включиться вновь практический любой из генов либо несколько генов одновременно.
Генная инженерия 2.0
Классическая система CRISPR-Cas9 использует ДНК-разрезающий фермент Cas9, обнаруженный в бактериях. Эта система может быть нацелена на определенные гены в клетках человека с помощью направляющей РНК, указывающей белкам Cas9, в каком участке нужно разорвать цепь ДНК. Образовавшееся после редактирования повреждение ДНК закрывается существующим в клетке ремонтным комплексом.
Классический метод CRISPR-Cas9 изменяет основную последовательность ДНК, поэтому дает постоянный и необратимый эффект. Кроме того, зависимость от собственных клеточных механизмов восстановления означает, что будет трудно ограничиться одним желаемым изменением и полностью контролировать результаты.
Поэтому исследователи искали возможность для другого типа генного редактора, такого, который не меняет последовательность ДНК, но изменяет способ ее считывания в клетке.
Такого рода модификации ученые называют эпигенетическими – гены могут быть отключены или активированы на основе химических изменений в цепи ДНК. Эпигенетическое глушение генов часто работает через метилирование – добавление химических меток к определенным фрагментам в цепи ДНК, которые делают их недоступными для фермента РНК-полимеразы, считывающей генетическую информацию с ДНК в матричную РНК, с которой, в свою очередь, строятся белки. Вайсман и коллеги ранее создали два других эпигенетических редактора CRISPRi и CRISPRa, но оба они могли работать только в клетках, постоянно экспрессирующих искусственные белки, сохраняющие эпигенетические изменения.
Создание выключателя
Чтобы построить эпигенетический редактор CRISPRoff, который мог бы имитировать естественное метилирование ДНК, исследователи создали белковую структуру, управляемую РНК, которая может выключать целевые гены, прикрепляя метильные группы к определенным точкам на цепи ДНК.
Поскольку новый метод не изменяет последовательность ДНК, исследователи могут обратить вспять эффект глушения с помощью ферментов, которые удаляют метильные группы. Этот метод они назвали CRISPRon.
Тестируя CRISPRoff в различных условиях, исследователи обнаружили несколько интересных особенностей новой системы. Во-первых, они смогли нацелить ее на подавляющее большинство генов в геноме человека, и это работало не только для самих генов, но и для других областей ДНК, которые контролируют экспрессию генов, но не кодируют белки.
Кроме того, CRISPRoff заставил замолчать гены, которые не имеют CpG-островков – областей, ранее считавшихся необходимыми для любого механизма метилирования ДНК. До этой работы считалось, что 30% генов, не имеющих CpG-островка, не контролируются метилированием ДНК.
CRISPRoff в исследованиях и терапии
Чтобы исследовать потенциал CRISPRoff для практического применения, ученые протестировали этот метод на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Эти клетки могут превращаться в бесчисленные типы клеток в организме в зависимости от коктейля молекул, которые их окружают, и, таким образом, являются мощными моделями для изучения развития и функционирования определенных типов клеток.
Исследователи выбрали ген, который с помощью CRISPRoff отключили в стволовых клетках, а затем превратили их в нейроны. Когда они искали тот же самый ген в нейронах, то обнаружили, что он оставался молчащим в 90% клеток, доказывая, что клетки сохраняют память об эпигенетических модификациях, сделанных системой CRISPRoff, даже когда меняется тип клеток.
Исследователи также показали, как CRISPRoff может быть применен для терапии: они выбрали в качестве цели ген, кодирующий тау-протеин, который связан с болезнью Альцгеймера. Использование CRISPRoff снизило экспрессию этого белка в нейронах, хотя и не отключило полностью.
Но даже если CRISPRoff не способен вылечить болезнь Альцгеймера, есть много других состояний, при которых он потенциально может быть применен. Пока доставка в определенные ткани остается проблемой для технологий редактирования генов, включая CRISPRoff, однако авторы показали, что можно доставить его с помощью векторных систем.
CRISPRoff обладает большим потенциалом для исследований, давая возможность ученым заставить замолчать любую часть генома; это отличный инструмент для изучения функции определенных генов.
Кроме того, наличие надежной системы для изменения эпигенетики клетки поможет исследователям изучить механизмы, с помощью которых эпигенетические вмешательства передаются через клеточные деления.
Статья J.K.Nuñez et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing опубликована в журнале Cell.
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» vechnayamolodost.ru по материалам Whitehead Institute: An on-off switch for gene editing.
