Технология CRISPR-Cas, разработанная в 2012 году, способна устранять дефекты в генах и заменять их целыми элементами. Новейшая версия CRISPR работает по-другому. Цель заключается в исправлении ошибки в генах без пересечения нити ДНК и, следовательно, более безопасном редактировании генов.
Новый вариант фермента CRISPR разработан в США в 2018 году, он работает более точно и дает меньше ошибок. Исследователи Маартен Гёртс из Института Хюбрехта и Эйлин де Поэль из Университетского медицинского центра в Утрехте, Нидерланды, смогли с помощью так называемого редактирования нуклеотида аденина (adenine base editing) отремонтировать дефектный нуклеотид на месте, не вырезая его из цепи и не заменяя его на здоровый.
Предыдущие исследования показали, что данный метод генетической коррекции безопасен в стволовых клетках риса и мышей. Утрехтское исследование показало, что редактирование аденина также эффективно и безопасно работает в стволовых клетках человека.
Мини-кишечники
Исследователи воспользовались биобанком с кишечными органоидами. Это своего рода мини-кишечники, выращенные из стволовых клеток пациентов с муковисцидозом. Органоиды помогают исследовать, что именно происходит при кистозном фиброзе. Кроме того, они используются для поиска наиболее подходящего лекарства конкретному пациенту с муковисцидозом, а также для тестирования новых методов лечения, таких как CRISPR-Cas. В текущем исследовании ученые использовали биобанк органоидов, чтобы выяснить, работает ли адениновое редактирование в ДНК стволовых клеток человека и может ли оно использоваться для лечения муковисцидоза в тонком кишечнике.
Что идет не так при кистозном фиброзе?
Муковисцидоз (кистозный фиброз) вызывается мутацией в гене CFTR, приводящей к неспособности соответствующего белка выполнять свои функции. Как и все гены, CFTR представляет собой небольшую часть ДНК – длинной двойной цепи из четырех типов нуклеотидов: аденин, тимин, гуанин и цитозин (А, Т, Г, Ц). Нуклеотиды образуют длинный ряд трехбуквенных сочетаний, которые дают клетке информацию, необходимую для создания белков. Ген, затронутый при муковисцидозе, состоит из примерно 250 тысяч пар нуклеотидов.
У большинства пациентов с муковисцидозом отсутствуют всего одно «слово» из трех пар нуклеотидов, что приводит к отсутствию одной аминокислоты и образованию нефункциональной версии белка.
У оставшейся части больных замена всего одного нуклеотида меняет триплет, кодирующий аминокислоту, на стоп-кодон – тринуклеотид, который сигнализирует, что ген заканчивается. В частности, стоп-кодон появляется слишком рано, если пара оснований ГЦ заменяется на АТ. Это можно исправить, изменив А в «ложном» стоп-кодоне обратно на Г.
Таким образом, две группы пациентов с кистозным фиброзом имеют различный дефект в гене CFTR с одинаковым результатом: клетка не синтезирует нормальный белок CFTR, необходимый в организме для транспорта хлорида и воды через клетки слизистой оболочки многих органов. Если этого не происходит, слизь в органах недостаточно увлажняется и становится плотной. В результате различные органы (легкие, поджелудочная железа, репродуктивные органы) не работают должным образом, их функция постепенно снижается.
Для большой группы пациентов с муковисцидозом, у которых отсутствует тринуклеотид в ДНК, теперь доступны эффективные лекарства. Но для второй группы, с ошибочным стоп-кодоном, лечения нет. Поэтому новая методика редактирования аденина была испытана на стволовых клетках пациентов с муковисцидозом с преждевременным стоп-кодоном.
Как работает однонуклеотидное редактирование CRISPR?
Фермент Cas в традиционной технике CRISPR-Cas идентифицирует дефектный фрагмент ДНК и вырезает его. В новой модификации инструмент также находит ошибку ДНК, но не устраняет её. Цель аденинового редактирования CRISPR при кистозном фиброзе заключается в восстановлении гена CFTR путем замены неправильного основания А на Г. Для этого к ферменту присоединен белок, который разрушает А таким образом, что он становится похожим на Г. Клетка, которая способна восстанавливать неполноценные нуклеотиды, теперь распознает его как Г и заменяет на нормальный Г. Таким образом, тринуклеотид больше не распознается как стоп-кодон, и белок CFTR синтезируется полностью.
Исследователям удалось отредактировать гены CFTR в органоидах кишечника из биобанка: клетки в восстановленных мини-кишечниках продуцировали правильный белок CFTR.
Важная особенность аденинового редактирования CRISPR заключается в том, что оно, похоже, узко специфично. Известно, что самый большой недостаток традиционной технологии CRISPR-Cas состоит в том, что она не только устраняет ошибку, но также отсекает здоровые фрагменты ДНК. Это приводит к непреднамеренному повреждению ДНК. Новая технология более точна, лучше распознает неправильную последовательность ДНК и изменяет только ее. Это подтверждено в исследовании: не было каких-либо дополнительных повреждений ДНК в восстановленном мини-кишечнике.
Органоиды тонкого кишечника пациента с муковисцидозом (слева), которые не набухают из-за мутации в гене CFTR, и набухшие после исправления мутации (справа). Изображение: Eyleen de Poel и Maarten Geurts, авторские права UMC Utrecht и Hubrecht Institute.
Дальнейшие шаги
Демонстрация работы метода лаборатории, тем не менее, не означает, что пациенты уже могут извлечь из него пользу. Перед внедрением в клиническую практику нужно убедиться, что фермент достигнет цели в условиях живого организма. Муковисцидоз является достаточно сложным для лечения заболеванием, так как затрагивает множество различных функций организма. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы убедиться, что этот новый метод базового редактирования CRISPR может применяться в клинике.
Кроме того, существуют этические аспекты генетического редактирования клеток. Теоретически этот метод также может быть использован для смены клеток, например, у эмбрионов. Дискуссии на эту тему пока не привели к какому-то решению.
Статья M.H.Geurts et al. CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank опубликована в журнале Cell Stem Cell.
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Hubrecht Institute: Curing genetic disease in human stem cells.
