The real-time quaking-induced conversion assay for detection of human prion disease and study of other protein misfolding diseases

Разработчики

Маттиас Шмитц, Мария Крамм, Байрон Коги, Инга Зерр и др.

Описание технологии

Разработка и адаптация систем амплификации неправильно свернутых белков in vitro былa одной из основных новаторских разработок для обнаружения Скрейпи − прионного заболевания, вызванного аномально свернутым белком − в образцах человеческого мозга и спинномозговой жидкости.

Рассматриваемая технология представляет собой быстрый и эффективный метод амплификации белка с помощью индуцированной вибрацией конверсии в режиме реального времени для обнаружения «центров кристаллизации» неправильно свернутых прионных белков в человеческом мозге и спинномозговой жидкости. В отличие от других методов амплификации in vitro неправильно сложенных белков, например, циклической амплификации неправильно свернутого белка, основанной на обработке ультразвуком, метод амплификации белка с помощью индуцированной вибрацией конверсии в режиме реального времени основан на неправильном сворачивании белков, индуцированном «центрами кристаллизации», и агрегации субстрата рекомбинантного прионного белка, ускоренной чередующимися циклами встряхивания и оставления в покое в флуоресцентных планшетах ридеров. За один анализ обычно исследуется до 32 образцов в трех экземплярах, с использованием формата 96-луночного планшета. Выполнение протокола от стадии подготовки пробы до окончания анализа результатов занимает ~ 87 часов. Кроме диагностики, этот метод имеет существенные общие аналитические приложения, в том числе скрининг лекарственных средств, определение штамма приона, скрининг биологической опасности (например, для снижения риска передачи прионных заболеваний) и изучение неправильного сворачивания белка. Также он потенциально может быть использован для исследования других заболеваний вследствие неправильного сворачивания белков, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Практическое применение

Эта технология, основанная на реакциях индуцированной вибрацией конверсии в режиме реального времени в формате 96-луночных планшетов в автоматизированном режиме, позволяет провести высокопропускной анализ образцов и увеличивает потенциальные возможности многих других приложений в научных и промышленных областях. Анализ методом индуцированной вибрацией конверсии в режиме реального времен был разработан для большинства прионных штаммов и многих человеческих и животных тканей и жидкостей организма, что делает его применимым для диагностики, биологических исследований, предварительного скрининга потенциальных терапевтических средств и испытания материалов на загрязнение инфекционными прионами. Примеры многообразных применений этого метода включают в себя диагностику прионных заболеваний человека в спинномозговой жидкости и назальном отделяемом; типирование штаммов прионов и т. п.

Лаборатории

• Department of Neurology, University Medical Center Göttingen and German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), Göttingen (Germany)
• Department of Medicine, The University of Melbourne, Parkville (Australia)
• Department of Molecular Microbiology and Immunology, Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki (Japan)
• Laboratory of Persistent Viral Diseases, Rocky Mountain Laboratories, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH), Hamilton (USA)

Ссылки

Публикации

• Schmitz, M. et al. «The real-time quaking-induced conversion assay for detection of human prion disease and study of other protein misfolding diseases." 11 Nature Protocols (2016): 2233–2242.
• Schmitz, M. et al. «Application of an in vitro-amplification assay as a novel pre-screening test for compounds inhibiting the aggregation of prion protein scrapie." 6 Sci. Rep. (2016): 28711.
• Schmitz, M. et al. «Validation of 14-3-3 protein as a marker in sporadic Creutzfeldt-Jakob diagnostic." 53 Mol. Neurobiol. (2016): 2189–2199.