Различные in vivo и in vitro трансформации стволовых клеток кишечника при недостаточности репарации ошибок спаривания оснований

Разработчики

Керстин Кейссельт, Карен Ротер, Йорг Галле, Габриэла Ауст и др.

Описание технологии

Эта технология была создана для изучения формирования синдрома Линча/наследственного неполипозного колоректального рака, включая возникновение его в процессе старения организма. Он возникает вследствие гетерозиготных мутаций в генах репарации ошибок спаривания оснований (MMR) зародышевых клеток. Среди них наиболее распространенными являются мутации MutS гомолога 2 (MSH2) и MutL гомолога 1 (MLH1). Мутации генов MMR приводят к микросателлитной нестабильности (MSI) и раннему началу колоректального рака.

Для разработки этой технологии использовалась модель культуры клеток кишечного эпителия. Кишечный эпителий поддерживается за счет стволовых клеток кишечника (ISCs). Идентификация сигнальных путей, ответственных за их самообновление, позволила создать ISC культуры из изолированных кишечных крипт с образованием органоидов. В этом контексте термин «органоид» используется для обозначения структур, которые формируются в культуре in vitro из стволовых клеток кишечника и напоминают структуры нормального кишечника или опухолей кишечника. Кинетика и состав клеточных типов этих органоидов отражает процессы, происходящие in vivo, что делает их перспективной моделью для изучения трансформации ISC, возникающей вследствие инактивации генов MMR с течением времени.

Были исследованы время, последовательность и развитие молекулярных и фенотипических изменений в эпителии, предшествующих возникновению кишечных опухолей. Для анализа профиля трансформаций стволовых клеток кишечника (ISC) было проведено количественное определение MSI и характеристик роста органоидов у Msh2-дефицитных и контрольных мышей от момента рождения до образования опухоли, а также экспрессии связанных с ними генов. Хотя в Msh2-дефицитных органоидах MSI постоянно увеличивается от рождения, характеристики роста сначала оставались стабильными. За несколько месяцев до начала роста опухоли, в нормальной Msh2-дефицитной ткани отмечались клетки-предшественники, формирующие органоиды с более высоким MSI, кистозным ростом и темпами роста, напоминающими по временной характеристике темпы роста опухолевых органоидов. Msh2-дефицитные ткани проявляли опухолеподобные генные сигнатуры. Нормальные Msh2-дефицитные органоиды показывали повышенный наследственный транзиторный кисто-подобный рост, который был независимым от R-спондина. Трансформация ISC in vitro происходила быстрее, чем in vivo независимо от базового генотипа, но была более выраженной при недостаточности MMR.

В целом, на модели с использованием органоидов было выявлено, что в MMR-дефицитном кишечнике молекулярные изменения непрерывно происходили еще задолго до появления опухоли, тем самым увеличивая его восприимчивость к трансформации ISC. Накопление мутаций, особенно в Msh2-/- ткани или органоидах, может также отражать процесс старения, поэтому используемая модель пригодна для изучения формирования колоректального рака в процессе старения.

Практическое применение

Технология, использующая органоиды кишечника мышей с дефицитом репарации ошибок спаривания оснований и органоиды контрольных мышей, позволяет исследовать и понять накопление генетического дисбаланса в процессе старения, долгосрочной культуры и прекращения действия фактора роста стволовых клеток кишечника.

Это исследование дает возможность разрабатывать ранние вмешательства, подавляющие важные стадии пре-неопластической трансформации в кишечнике и создавать новые подходы к противораковой терапии.

Лаборатории

• Department of Surgery, Research Laboratories, University of Leipzig, Leipzig (Germany)
• Interdisciplinary Center for Bioinformatics (IZBI), University of Leipzig, Leipzig (Germany)
• Interdisciplinary Center for Clinical Research Leipzig (IZKF), Core-Unit DNA Technologies, University of Leipzig, Leipzig (Germany)
• Institute for Medical Statistics, Informatics and Epidemiology, University of Leipzig, Leipzig (Germany)

Ссылки

Публикации

• Keysselt, K. et al. «Different in vivo and in vitro transformation of intestinal stem cells in mismatch repair deficiency." Oncogene, 2016 Dec 12. doi:10.1038/onc.2016.429. (Advance online publication).
• Hamidouche, Z. et al. «Bistable Epigenetic States Explain Age-Dependent Decline in Mesenchymal Stem Cell Heterogeneity." Stem Cells. 2016 Oct 13. doi: 10.1002/stem.2514
• Thalheim, T. et al. «Stem cell competition in the gut: insights from multi-scale computational modelling." 13.121 J R Soc Interface. (2016): 20160218.