Перепрограммирование нейронов сетчатки мышей и стандартизированная квантификация их дифференцировки в 3D культурах сетчатки глаза

Разработчики

Дэниель Дж. Хилер, Мария Э. Барабас, Лира М. Гриффитс, Майкл А. Дайер.

Описание технологии

Технология предназначена для перепрограммирования нейронов сетчатки мышей в плюрипотентные стволовые клетки. Постмитотические дифференцированные нейроны − одни из самых неподатливых клеток для перепрограммирования в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), поскольку имеют низкую жизнеспособность при культивировании в виде диссоциированных клеток. Чтобы преодолеть эту проблему, другие технологии используют для перепрограммирования постмитотических нейронов инактивацию супрессора опухолей р53, что может привести к онкогенезу клеток.

В противоположность этому данная технология не требует инактивации р53, индуцируя перепрограммирование в клетках сетчатки, которые взяты у перепрограммированных мышей и выращены в агрегатах с клетками сетчатки, взятыми у мышей дикого типа. После первых 10 суток перепрограммирования, агрегаты диспергировали и высевали на облученные питающие клетки для размножения и выделения отдельных клонов iPSCs. Эффективность перепрограммирования различных популяций нейронов на любой стадии развития может быть определена количественно с использованием протокола по данной технологии. Перепрограммирование нейронов сетчатки глаза с помощью этого протокола занимает 56 дней, и полученные из клеток сетчатки iPSCs могут подвергаться дифференцировке в новые клетки сетчатки и образовывать сетчатку за 34 дня. Кроме того, протокол содержит описание количественной оценки дифференцировки этих iPSC-производных нейронов. Этот метод квантификации называется STEM-RET. Процедура включает количественное определение характеристик полей глаза, формирование глазного бокала и дифференцировку клеток сетчатки глаза в 3D культуре с использованием молекулярных, клеточных и морфологических критериев.

Практическое применение

Технология перепрограммирования нейронов сетчатки и количественной оценки их дифференцировки в новые клетки сетчатки позволяет исследователям производить стволовые клетки различных линий, взятых у перепрограммированных мышей и определять наилучший источник стволовых клеток для изучения развития сетчатки и ее болезней, а в перспективе − для клеточной терапии ретинопатии человека.

Хотя метод STEM-RET был разработан с применением мышиных стволовых клеток, он может быть легко адаптирован для стволовых клеток человека с использованием более длительного периода культивирования. Для выполнения аналогичных исследований с сетчаткой человека должны быть использованы маркеры клеточной поверхности. Протокол STEM-RET может быть использован для количественного сравнения различных линий стволовых клеток с целью определения тех из них, которые являются наиболее эффективными для создания фоторецепторов в культуре и последующей их трансплантации или моделирования заболевания.

Протокол STEM-RET обеспечивает четкий, стандартизованный метод количественной оценки ретиногенеза in vitro различных линий стволовых клеток, независимо от происхождения.

Лаборатории

• Department of Developmental Neurobiology, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis (USA)
• Department of Ophthalmology, University of Tennessee Health Science Center, Memphis (USA)
• Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase (USA)

Links

Публикации

• Hiler, D.J. et al. «Reprogramming of mouse retinal neurons and standardized quantification of their differentiation in 3D retinal cultures." 11 Nature Protocols (2016): 1955–1976.
• Hiler, D. et al. «Quantification of retinogenesis in 3D cultures reveals epigenetic memory and higher efficiency in iPSCs derived from rod photoreceptors." 17 Cell Stem Cell (2015): 101–115.