Обнаружение апоптоза лейкоцитов в лимфатических узлах у мышей

Разработчик

Лаура Гомес-Кабаньяс, Кристина Дельгадо-Мартин Лорена Риол-Бланко, Хозе Луис Родригес-Фернандес и др.

Описание технологии

Несмотря на то, что существует несколько методов анализа апоптоза в культуре клеток (например, терминальное дезоксиуридиновое мечение концов (TUNEL), флоуцитометрическое определение маркеров апоптоза в клеточных суспензиях и др.), методики анализа апоптоза in vivo немногочисленны.

Главной составной частью этой технологии служит протокол, описывающий процедуру определения апоптоза лейкоцитов в лимфатических узлах у мышей с помощью обнаружения апоптотических каспаз. Ранее этот протокол был использован для изучения факторов, которые модулируют выживание дендритных клеток в лимфатических узлах. Тем не менее, он также может применяться для анализа других лейкоцитов, мигрирующих в лимфатические узлы. Дендритные клетки были помечены флуоресцентным трекером клеток при его введении подкожно в задние лапы мышей. После того, как меченые дендритные клетки достигали подколенных лимфатических узлов, животным внутривенно вводили детектор апоптоза, конъюгированный с флуоресцентным красителем (FLIVO − Fluorescence In Vivo) в проникающем флуоресцентном реагенте, который селективно помечает активные каспазы и, следовательно, апоптотические клетки. Затем, извлеченные из организма подколенные лимфатические узлы исследовали при помощи двухфотонного микроскопа для того, чтобы найти присутствие апоптотических клеток среди инъецированных дендритных клеток. Протокол требует 6−6,5 ч для подготовки и анализа и дополнительно 34−40 ч для того, чтобы дать возможность произойти апоптозу инъецированных дендритных клеток в подколенных лимфатических узлах.

Практическое применение

Важным преимуществом протокола, предлагаемого в данной технологии, является его применимость для изучения выживаемости лейкоцитов и, особенно, дендритных клеток in vivo.

Этот протокол также может быть использован для изучения выживаемости других лейкоцитов, мигрирующих в лимфатические узлы. В связи с этим, протокол может применяться для изучения любого типа клеток, которые экспрессируют рецептор хемокинов CCR7, который отвечает за миграцию лейкоцитов и других клеток в лимфатические узлы. Типы клеток, которые мигрируют в лимфатические узлы включают В-клетки, наивные Т-клетки и T-клетки центральной памяти и некоторые типы моноцитов и макрофагов.

Примечательно, что некоторые метастатические клетки, включая клетки меланомы, немелкоклеточного рака легкого, рака желудка и рака пищевода также экспрессируют CCR7 и/или CXCR4 и могут мигрировать в лимфоузлы. Это подразумевает, что выживание таких клеток или их апоптоз в ответ на различные виды лечения могут также быть легко проанализированы с помощью этой стратегии.

Метод также может быть использован для анализа выживаемости лейкоцитов или других клеток типов не только у мышей, но и у других видов, при условии, что изучаемые клетки должны подвергаться каспаза-опосредованным механизмам апоптоза и что они могут быть отслежены, либо путем маркировки их прижизненными маркерами, либо применением других альтернативных стратегий для последующего анализа с помощью двухфотонной микроскопии.
Таким образом, технология может быть перспективна для применения в изучении различных болезней (иммунных заболеваний, рака и т. д.), процессов старения, в том числе клеточного старения, поиска новых лекарств и т. п.

Лаборатории

• Centro de Investigaciones Biológicas. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid (Spain)
• Centro de Microscopía y Citometría, Universidad Complutense, Madrid (Spain)
• Present address: Department of Microbiology and Immunobiology, Harvard Medical School, Boston (USA)

Ссылки

Публикации

• Gómez-Cabañas, L. et al. «Detecting apoptosis of leukocytes in mouse lymph nodes." 9 Nature Protocols (2014): 1102–1112.
• Delgado-Martin, C. et al. «Chemokine CXCL12 uses CXCR4 and a signaling core formed by bifunctional Akt, extracellular signal-regulated kinase (ERK)½, and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) proteins to control chemotaxis and survival simultaneously in mature dendritic cells." 286 J. Biol. Chem. (2011): 37222–37236.
• Rey-Gallardo, A. et al. «Polysialic acid is required for neuropilin-2a/b-mediated control of CCL21-driven chemotaxis of mature dendritic cells and for their migration in vivo." 21 Glycobiology (2011): 655–662.