Мультиплексный многопараметрический анализ митохондриальной морфофункции с использованием микроскопии живых клеток

Разработчики

Элиджио Ф. Ианетти, Йен А. М. Смейтинк, Петер Х.Г. М. Вилемс, Вернер Дж. Х. Коопман и др.

Описание технологии

Митохондрии играют центральную роль в клеточной физиологии и патофизиологии. Их морфология отличается высокой изменчивостью, что, вероятно, сопряжено с их функциональным состоянием.

Технология дает возможность провести объективный и автоматизированный количественный анализ митохондриальной морфофункции (то есть, морфологии и мембранного потенциала), клеточных параметров (размера, слияния элементов структур) и ядерных параметров (числа, морфологии) в неповрежденных живых первичных фибробластах кожи человека.

Клетки культивировали в 96-луночных планшетах и окрашивали родамин тетраметил-метиловым эфиром, кальцеин-ацетокси-метиловым эфиром и красителем Hoechst 33258. Затем, получали изображения мультиспектральной флуоресценции с использованием автоматизированной микроскопии и подвергали их обработке с целью извлечения 44 дескрипторов (то есть, соответствующих митохондриальных параметров, таких как интенсивность флюоресценции и форма митохондрий на изображениях). Далее данные дескрипторов обрабатывали согласно алгоритму контроля качества на основе анализа главных компонент и интерпретировали с использованием одномерного, двумерного и многомерного анализа.

На выполнение протокола по данной технологии требуется время около 4 ч, распределенное на протяжении 2 суток. Хотя протокол специально разработан для первичных фибробластов кожи человека, которые широко используются в доклинических исследованиях, он может быть адаптирован к другим типам клеток и масштабирован для применения в многопараметрическом скрининге с высоким содержанием компонентов.

Практическое применение

Технология анализа митохондриальной морфофункции перспективна как для фундаментальной науки, так и для медицинской практики. Митохондрии − это клеточные органеллы, которые обладают широким спектром функций клеточного метаболизма. Функциональные нарушения митохондриального и/или клеточного метаболизма часто связаны с аберрациями в митохондриальной морфологии, и наоборот. Эти нарушения наблюдаются не только в редких моногенных митохондриальных болезнях, но также связаны с общими патологиями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, рак, болезни сердца, диабет, эпилепсия и ожирение. Кроме того, прогрессирующее снижение экспрессии митохондриальных генов является центральным элементом нормального старения человека. Это означает, что поддержание нормальной митохондриальной морфофункции имеет огромное значение для здоровья человека и, как следствие, стратегии оценки этой морфофункции являются предметом большого интереса для экспериментальных исследований, фармакологического скрининга и клинической диагностики. Таким образом, эта технология может стать весьма ценным инструментом для изучения многих физиологических и патологических процессов, упомянутых выше.

Лаборатории

• Department of Biochemistry, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen (the Netherlands)
• Khondrion BV, Nijmegen (the Netherlands)
• Department of Pediatrics, Radboud Center for Mitochondrial Medicine, Radboudumc, Nijmegen (the Netherlands)
• Centre for Systems Biology and Bioenergetics, Radboudumc, Nijmegen (the Netherlands)

Ссылки

Публикации

• Iannetti, E.F. et al. «Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy." 11 Nature Protocols (2016): 1693–1710.
• Iannetti, E. et al. «High-content and high-throughput analysis of mitochondrial dynamics." 63 Int. J. Biochem. Cell Biol. (2015): 66–70.
• Koopman, W.J.H. et al. «Mitochondrial network complexity and pathological decrease in complex I activity are tightly correlated in isolated human complex I deficiency." 289 Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2005): C881-C890.