Идентификация сайтов SUMO с помощью протеомной стратегии двойной очистки с высоким выходом

Разработчик

Иво А. Хендрикс и Альфред С. О. Вертегаал.

Описание технологии

Малый убиквитин-подобный модификатор (SUMO) представляет собой белок-модификатор, который посттрансляционно связывается с тысячами остатков лизина в более чем тысяче белков. Знание того, какие остатки лизина модифицируются SUMO, имеет решающее значение в разгадке его функции как главного регулятора всех процессов в ядре клетки, а также определении его участия в развитии таких заболеваний, как рак.

Технология позволяет провести лизин-дефицитный (K0) метод эффективной идентификации сумоилированных лизинов с помощью масс-спектрометрии. Метод K0 является в настоящее время единственным доступным методом, который может идентифицировать более 1000 SUMO-сайтов в клетках млекопитающих в стандартных условиях культивирования. Стратегия K0 основана на введении His10-меченого SUMO, в котором все остатки лизина замещены на остатки аргинина. Дефицит лизина делает SUMO невосприимчивым к расщеплению в эндопротеиназой Lys-C, что, в свою очередь, позволяет провести тандемную очистку с применением гистидиновой метки His10 с высоким выходом. Кроме того, His10-меченый SUMO также содержит Q87R мутацию C-конца, которая позволяет совместить производство пептидов SUMO-сайта с образованием QQTGG остатка в результате расщепления трипсином. Этот остаток обладает уникальной сигнатурой массы и легко образует диагностические ионы при сканировании ионных фрагментов, что повышает достоверность идентификации SUMO-сайта. Метод K0 может быть применен к любой линии клеток млекопитающих или в любой модельной системе, которая позволяет интеграцию K0-SUMO конструкта. Метод K0 требует для своего выполнения ~7 дней с момента лизиса клеток.

Практическое применение

Белки, модифицированные SUMO, локализуются преимущественно в ядре, и SUMO регулирует практически все ядерные процессы, включая регуляцию клеточного цикла и репарацию ДНК. SUMO также участвует в развитии таких заболеваний, как рак, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, что делает SUMO потенциальной терапевтической мишенью. Таким образом, данная технология как метод идентификации SUMO-сайтов может оказаться перспективной для использования в области поиска новых лекарственных средств с целью отыскания и разработки лекарственного препарата, целенаправленно воздействующего на SUMO как на мишень, для лечения ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.

Лаборатории

• Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center, Leiden (the Netherlands)

Ссылки

Публикации

• Hendriks, I.A. and Vertegaal A.C.O. «A high-yield double-purification proteomics strategy for the identification of SUMO sites." 11 Nature Protocols (2016): 630–1649.
• Hendriks, I.A. et al. «Uncovering global SUMOylation signaling networks in a site-specific manner." 21 Nat. Struct. Mol. Biol. (2014): 927–936.
• Eifler, K. & Vertegaal, A.C. «Mapping the SUMOylated landscape." FEBS J. (2015).