Эффективное введение специфических мутаций TP53 в мышиные эмбриональные фибробласты и эмбриональные стволовые клетки

Разработчики

Кван Ксянг Вей, Францискус ван дер Хевен, Моника Хольстейн, Адам Ф. Оделл и др.

Описание технологии

Клинические исследования для оценки фенотипического влияния различных классов опухолевых мутаций гена Trp53, кодирующего супрессор опухолей — белок p53, затруднено из-за гетерогенности опухолей и генетического разнообразия человеческих популяций. Для того, чтобы уменьшить генетический шума наиболее подходящим подходом являются in vitro исследования с использованием изогенных клеточных линий или р53-нулевых клеточных линий, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими различные мутанты.

Рассматриваемая технология дает быстрый, точный способ для генерации эмбриональных стволовых клеток или эмбриональных фибробластов мыши, несущих точечные мутации в гене Trp53. В стратегии, на которой основана данная технология, используются клетки из новой линии мышей − мышиной клеточной «платформы» Trp53 (р53-нуль), которая дает возможность сайт-специфической интеграции ДНК плазмиды в локус гена Trp53. Правильная идентифицикация целевых клонов проводится с помощью простых протоколов ПЦР, а реэкспрессия белка верифицируется посредством иммуноблотов. Разработаны также модификации протокола для эффективного извлечения клонов мышиных эмбриональных фибробластов, экспрессирующих такие конструкты p53, которые сохраняют функцию дикого типа, в том числе рост при низкой концентрации (3%) кислорода и временную деактивацию регуляторов p53 для предотвращения клеточного старения первичных мышиных эмбриональных фибробластов. Библиотека клеточных линий, экспрессирующих различные мутанты р53, полученные из той же популяции первичных фибробластов или эмбриональных стволовых клеток, может быть создана и подвергнута скринингу менее чем за 1 месяц.

Практическое применение

Технология позволяет изучать мутантные фенотипы in vitro с использованием клеточных систем эмбриональных стволовых клеток или эмбриональных фибробластов мыши. Дополнительные приложения могут включать в себя следующее.

Спаривание мышей этой платформы с другими трансгенными мышами может использоваться в качестве эффективного способа исследования того, как специфические генетические дефекты других генов/путей рака влияют на поведение мутанта р53.

Эти мутантные клеточные линии эмбриональных стволовых клеток могут быть использованы для создания новых p53-мутантных штаммов более экономически эффективным образом.
Вполне возможно, что другие первичные клетки мышей этой платформы могут быть использованы в качестве исходного материала для TOP интеграции и генерации клонов.

Любая вызывающая интерес последовательность (например, трансген, с промотором и полной кодирующей последовательностью), если она фланкирована на концах сайтами attP, может быть интегрирована в сайт платформы.

Могут быть также получены условные аллели гена p53 (модификации TOP плазмиды: LoxP, флуоресцентная метка, индуцируемые двухпозиционные системы). Это могло бы быть использовано для получения линий эмбриональных фибробластов мыши, сохраняющих функции дикого типа р53.

Лаборатории

• Genetic Alterations in Carcinogenesis (C016), German Cancer Research Center (Deutsches Krebsforschungszentrum), Heidelberg (Germany)
• Transgenic Service (W450), German Cancer Research Center (Deutsches Krebsforschungszentrum), Heidelberg (Germany)
• Faculty of Medicine and Health, Leeds Institute of Genetics, Health and Therapeutics (LIGHT) Laboratories, University of Leeds, Leeds (UK)

Ссылки

Публикации

• Wei, Q.X. et al. «Efficient introduction of specific TP53 mutations into mouse embryonic fibroblasts and embryonic stem cells." 7 Nature Protocols (2012): 1145–1160.
• Wei, Q.X. et al. «Rapid derivation of genetically related mutants from embryonic cells harboring a recombinase-specific Trp53 platform." 10 Cell Cycle (2011): 1261–1270.
• Odell, A., Askham, J., Whibley, C. & Hollstein, M. «How to become immortal: let MEFs count the ways." 2 Aging (Albany NY) (2010): 160–165.