CRISPR/Cas9

Разработчики

Дженнифер Дудна, Хуан Юнцзю, Занг Фенг и др.

Описание технологии

Существовавшие к настоящему времени системы редактирования генома (трансгенез с трансгенез с использованием гомологичной рекомбинации у мышей, а также применение различных вирусных векторов) не позволяют внести точные изменения в строго определенный локус генома.

Молекулярная система CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats; ry Interspaced Short Palindromic Repeats; короткие палиндромные повторы, расположенные группами, равномерно удаленными друг от друга)/Cas9 представляет собой новейшую технологию для высокоточного редактирования геномов. Эта система отличается относительной простотой конструирования и высокой эффективностью работы в клетках человека, животных и растений.

Система CRISPR/Cas9 позволяет внести двуцепочечный разрыв в целевой участок генома. Элементами системы CRISPR/Cas9 являются некодирующие РНК и белки Cas (CRISPR-as-sociated). Узнавание целевого сайта системой CRISPR/Cas осуществляется за счет комплементарного взаимодействия между некодирующей РНК — с одной стороны, и ДНК целевых сайтов — с другой. При этом образуется комплекс из некодирующих РНК и белков Cas, которые обладают хеликазной и нуклеазной активностью.

Система CRISPR/Cas9 создана на основе CRISPR/Cas-системы бактерий, которая представляет собой уникальный механизм, обеспечивающий защиту микроорганизмов от проникновения чужеродной ДНК (вирусов и фагов) и действующий, наряду с системой рестрикции-модификации, как ограничитель горизонтального переноса генетической информации.

Важным моментом при работе с системой CRISPR/Cas9 является тщательный подбор сайтов для специфичного внесения двухцепочечного разрыва. Необходимость предварительного биоинформатического анализа объясняется возможностью нецелевых эффектов — внесения неспецифичных двухцепочечных разрывов в геном. В настоящее время доступно on-line программное обеспечение, разработанное разными коллективами и предназначенное для выбора потенциальных сайтов системы CRISPR/ Cas9, а также определения возможных нецелевых эффектов.

Технология на стадии доклинических испытаний.

Практическое применение

Система CRISPR/Cas9 позволяет решать сложные задачи, включая создание и исследование моделей заболеваний на основе культивируемых плюрипотентных клеток человека. Так, создание панелей изогенных плюрипотентных стволовых клеток человека позволит осуществить моделирование наследственных и многофакторных заболеваний, скрининг больших библиотек лекарственных средств, а также поиск новых мутаций, вовлеченных в патологический процесс. Особенно актуальным представляется изучение тяжелых нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, различные мышечные атрофии.

Кроме того, методы, основанные на использовании системы CRISPR/Cas9, могут эффективно применяться для редактирования геномов культивируемых стволовых клеток. В частности, применение систем редактирования геномов позволяет исправлять точечные мутации в клетках, полученных от больных. Этот подход позволяет получать так называемые органоиды — функциональные многоклеточные образования с исправленным геномом, аутологичные по отношению к донору клеток, которые могут быть введены обратно в организм больного. Безусловно, данное направление открывает большие перспективы для клеточной терапии заболеваний человека.

Система CRISPR/Cas9 с каталитически неактивной dCas9 может использоваться как модульная платформа, связывающаяся с заданной нуклеотидной последовательностью и привлекающая к ней белковые факторы, тем самым открывая возможности использования этой системы как основного метода точной регуляции экспрессии генов в клетках человека.

Лаборатории

Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California (США)
Guangdong Province Key Laboratory of Reproductive Medicin, Sun Yat-sen University, Guangzhou, (Китай)
Laboratory of Genome Science, Biosignal Genome Resource Center, Institute for Molecular and Cellular Regulation, Gunma University, Gunma (Япония)

Ссылки

Публикации

Jinek, Martin, et al. «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science 337.6096 (2012): 816–821.
Liang, Puping, et al. «CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes." Protein & cell 6 (2015): 363–372.
Polcz, Sarah, and Anna Lewis. «Crispr-Cas9 and the Non-Germline Non-Controversy." Journal of Law and the Biosciences, Forthcoming (2015).
Slaymaker, Ian M., et al. «Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351.6268 (2016): 84–88.
Feng, Zhengyan, et al. «Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system." Cell research 23.10 (2013): 1229.
Horii, Takuro, et al. «Generation of an ICF syndrome model by efficient genome editing of human induced pluripotent stem cells using the CRISPR system." International journal of molecular sciences 14.10 (2013): 19774–19781.