Cкрининговая платформа для оценки клеточного дыхания у Caenorhabditis elegans

Разработчик

Мэнди Купман, Хелен Михелс, Эллен А. А. Ноллен, Рейкельт Х. Хоуткупер и др.

Описание технологии

Митохондриальная дисфункция лежит в основе многих заболеваний, начиная от наследственных болезней обмена веществ и заканчивая обычными состояниями, связанными со старением. Хотя взаимосвязи между старением и митохондриальной функцией были идентифицированы с использованием модели на млекопитающих, большая часть понимания механизмов действия возникла при изучении Caenorhabditis elegans. Митохондриальное дыхание рассматривается как показатель митохондриального здоровья. Респирометр Seahorse XF96 представляет собой платформу, внедренную для оценки дыхания в клетках, и авторы этой технологии адаптировали технику для приложений, связанных с C. elegans.

В данной технологии предлагается подробный протокол для оптимизации и измерения дыхания у C. elegans с использованием респирометра XF96, включая интерпретацию параметров и результатов. Протокол занимает ~2 дня до своего окончания, за исключением времени, затрачиваемого на культивирование C. elegans, и включает (i) подготовку образцов из организма C. elegans, (ii) отбор и загрузку соединений для инъекций, (iii) подготовку и проведение сеанса с респирометром XF96 и (iv) анализ постэкспериментальных данных, включая их нормализацию. Кроме того, приложение XF96 сравнивается с другими существующими методами, включая респирометрию с использованием респирометра Seahorse XFP в формате на восемь лунок. Основные преимущества XF96 включают ограниченное количество использующихся червей и высокую пропускную способность за счет 96-луночного формата.

Практическое применение

По сравнению с другими респирометрическими методами, подход на основе респирометра XF дает важные преимущества при измерении митохондриального дыхания у C. elegans, особенно при рассмотрении вопроса о легкости проводимых повторных измерений, сравнивая условия и параллельные анализы, а также исследования некоторых аспектов митохондриальной функции. Этот подход позволяет более высокую пропускную способность скрининга на основе таких приложений, как, например, геномные скрининги с целью поиска генетических интеракторов, влияющих на митохондриальную биоэнергетику и скрининг соединений с митохондриальной токсичностью. Действительно, XF респирометрия уже успешно применяется для изучения влияния соединений или генных нокдаунов на митохондриальную функцию у C. elegans.

Однако, in vivo оценка митохондриальной функции у C. elegans также имеет некоторые очевидные ограничения. Во-первых, потребление кислорода интактным организмом (например, базальное дыхание) не строго отражает дыхание митохондрий. Например, клетки обладают различными оксигеназами, которые также потребляют кислород и тем самым способствуют OCR43. Тем не менее, этот недостаток может быть преодолен с помощью специальных соединений, например, остаточное дыхание следует оценивать в присутствии эффективных ингибиторов транспорта электронов, чтобы отличить не-митохондриальное дыхание от митохондриального.

Этот метод может быть использован для долгосрочных, «хронических», наблюдений любых физиологических процессов в организмах и их взаимосвязи с респираторными функциями, например, для исследования процесса старения и изменений дыхательной функции, связанных с ним.

Лаборатории

• Laboratory of Molecular Neurobiology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Center Groningen, University of Groningen, Groningen (the Netherlands)
• Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung and Blood Institute, Bethesda (USA)
• Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam (the Netherlands)

Ссылки

Публикации

• Koopman, M. et al «A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans." 11 Nature Protocols (2016): 1798–1816.
• Andreux, P.A. et al. «A method to identify and validate mitochondrial modulators using mammalian cells and the worm C. elegans." 4 Sci. Rep. (2014): 05285.
• Houtkooper, R.H. et al. «Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism." 497 Nature (2013): 451–457.